José Antonio López Espinosa
	jale1@alu.um.es
	Universidad de Murcia, B I O L O G I A

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   Cuaderno de prácticas de Fundamentos de Biología Celular

Grupo 4, jueves 15:30 - 20:30.  Cuarto curso, plan 1996.

Desde el Inicio
 
Práctica I       práctica II       práctica III       práctica IV       práctica V       Práctica VI       ANEXOS

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Practica I.

Obtención y fijación de las muestras

  Comenzaremos con la descripción de los requerimientos básicos para trabajar en laboratorio:

• Máxima limpieza y orden.
• Elaborar previamente el plan de trabajo (comprobando que todos los reactivos estén en su estado adecuado).
• No fiarse de la memoria, realizar anotaciones para poder repetir la experiencia después, y así considerar los posibles errores.
• No probar, oler ni inhalar ninguno de los reactivos. Mantener a estos siempre en sus recipientes cerrados.
• Evitar contaminaciones, reutilizando los instrumentos para su manejo.
• No tirar nunca los productos por el desagüe.
• Preguntar siempre.

  Consideraciones fisico-químicas de algunos de los reactivos que vamos a utilizar.

La mayoría de los reactivos son líquidos, pero el agua solo podremos mezclarla con los alcoholes y el resto de los líquidos aclaradores no se podrán mezclar con agua pero sí con los alcoholes.

Los medios de inclusión más empleados son:
Parafina, en Microscopía óptica y resinas para microscopía electrónica. Estos dos medios de inclusión son mixibles en aclaradores, no en alcohol ni en agua.
En el caso de tener que utilizar ácidos deberemos tener en consideración el verter antes este que el agua. La mayoría de los líquidos que vamos a utilizar suelen ser fotosensibles, por lo que nuestros reactivos y colorantes deben mantenerse en oscuridad.

En HISTOLOGIA ANIMAL deberemos manejar y elaborar preparaciones con tejidos animales procediendo inicialmente a la Elección de la microscopía en la que se va a observar la muestra. Esto nos condicionara posteriormente los procedimientos a seguir y reactivos a utilizar. Un esquema general seria:

1. Fijación, buscando que se mantenga el mayor grado de similitud con el que tiene la estructura "in vivo", es decir, se pretende conservar la estructura de los tejidos tal y como se presentaba en el animal vivo.
2. Preparación de los frotis y cortes, realizando las correspondientes procesos de inclusión o congelación, con el fin de obtener cortes suficientemente finos que puedan ser observados al microscopio.
3. Coloración o tinción. Elección de los reactivos a usar según el tipo de tejido y sus estructuras particulares, así como la microscopía elegida.
4. Montaje de la muestra sobre el portaobjetos, o sobre la rejilla de cobre, según se trate.

  TIPOS DE FIJACIÓN.

Por métodos físicos:

• Calor: consiste principalmente en hacer pasar por la llama el tejido, coagulando las proteínas y fijándose las células y sus estructuras.
• Frío: se basa en la congelación rápida de la muestra, bien gaseando con CO₂ (cuyas propiedades hacen que descienda la temperatura hasta –75ºC y se endurezca la muestra) o sumergiendo esta en N₂ líquido, a –196ºC. Se persigue con esto sublimar el agua, evitando la formación de cristales de hielo, desde el interior al exterior celular, que destruye componentes y estructuras.

Son estos los procedimientos mas utilizados, y consisten en sumergir la muestra en una solución que contiene el compuesto fijador. La fijación química pretende inmovilizar componentes celulares, para evitar su modificación (gelificación, coagulación...), así como proceder a un primer lavado. Al mismo tiempo también se intenta que no se produzca la autolisis celular y la putrefacción, siendo muchos de los fijadores buenos antisépticos (combinan fijación y antisepsia). Otro fenómeno que se elimina con la fijación es el aumento de volumen, y en esta se intenta además endurecer en un primer paso la muestra al introducir un mordiente, eslabón entre muestra y colorante, que añadiremos mas tarde.
 
 

        TIPOS DE FIJADORES.

• SIMPLES.

Alcoholes: deshidratan la muestra, produciendo la precipitación de proteínas por coagulación.

Ácido pícrico: forma sales (pícritos).

Ácido acético: produce cambios coloidales en la célula. Bueno para fijar el núcleo, en particular los ácidos nucleicos. Tiene la desventaja de por sí solo ser un fijador muy pobre.

Formaldehido y glutaraldehido: actúan promoviendo la reticulación de lípidos y proteínas. Estos componentes celulares pasan a estado de gel, fijándose también algo los ácidos nucleicos.

• COMPLEJOS.

Componentes de la mezcla fijadora BOUIN son:

• Ácido pícrico: fija bien las proteínas.
• Formol (dilución acuosa de formaldehido al 10 %): fija algo los lípidos.
• Ácido acético: fija bien los ácidos nucleicos.

  DISECCIÓN DE RATA.

Organos a extraer:

Lengua à fijación con BOUIN, inclusión con parafina y tinción con el tricrómico de Mallory.

Traquea (para la observación de cartilagos con proteoglucanos metacromáticos) à fijación con BOUIN, inclusión con parafina y tinción con violeta de cresilo.

Cerebro à tejido muy sensible que será fijado con formol 10 %, inclusión en frio con CO₂ y corte con criostato (microtomo de congelación). Tinción con Hematoxilina-Eosina.

Higado, dos muestras à Ambas se fijan con formol al 10 %, se incluyen con parafina para teñirse posteriormente con PAS y PAS + amilasa, para ver la presencia de glucogeno, usando además un colorante de contraste para teñir el fondo de la celula; usaremos Hematoxilina.

Intestino grueso, dos muestras à Una muestra para microscopía óptica y poner de manifiesto las celulas caliciformes, productoras de mucus con glicoproteína. Estas se fijaran con BOUIN y se incluiran con parafina.

La muestra destinada para microscopía electrónica será fijada con glutaraldehido, lavada con tampón y posfijada con ácido ósmico.

Sangre à no se fijará, sino que se montara la preparación con balsamo (DPX) inmediatamente despues se haya teñido con Giemsa y secado la muestra.
 
 

  PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.

Muestras liquidas: Frotis de sangre. Una vez se haya abierto la rata y localicemos el corazón extraeremos de este sangre con la que realizaremos un frotis teñido con Giemsa. Consiste simplemente en depositar una pequeña gota de sangre sobre un porta limpio y extender esta sobre este con un cubre. Es importante obtener una delgada capa de la gota de sangre. Observaremos al microscopio los distintos tipos de células blancas y los eritrocitos, bastante distintos a los del hombre. La poca coloración del Giemsa en los citoplasmas y componentes ácidos puede deberse a que el lavado se ha realizado con agua básica, rica en carbonatos.

Muestras sólidas de tejidos: Habrá que proceder a fijar, preparar y montar la muestra para poder observarla al microscopio, tal y como se ha resumido anteriormente y se explicará en detalle mas adelante.

Cortes y extensión.

Una vez fijado el material deberemos prepararlo en el proceso de inclusión, consistente en la impregnación de nuestro tejido en un material plástico que nos facilitará la obtención de cortes finos.  Ya endurecido el material es necesario cortarlo con el microtomo.

• Deshidratar: necesario para que entre el material de inclusión en nuestra muestra, ya que este es hidrofóbico. La deshidratación se realiza sumergiendo el tejido durante un tiempo determinado (3’ el alcohol y 5’ los líquidos aclaradores como el xilol) en una serie de líquidos. La deshidratación para muestras destinadas a microscopía electrónica debe de ser mucho más severa.

• Añadir liquido intermediario, como el amilo acetato (I y II) empleado en microscopía óptica. Todas estas operaciones se llevan a cabo en la campana extractora de gases. En microscopía electrónica se emplea el óxido de propileno como líquido intermediario antes de incluir EPO, e incluso es generalizado el realizar diluciones con distintas concentraciones EPO:líquido_intermediario que permiten una impregnación más lenta y adecuada.

• Aplicación del medio de inclusión: Parafina liquida a 45º C, que solidifica a tª ambiente. Para microscopía electrónica se utiliza EPO (mezclas de resinas epoxi o epoxi-resinas ). Hay que tener en cuenta que es muy importante la continuidad de todo este proceso, una vez empezado no se puede detener.  Los líquidos intermediarios disuelven el alcohol y lo sustituyen, al mismo tiempo que favorecen la entrada del medio de inclusión, misión fundamental de estos.

En microscopía electrónica no se emplean técnicas de tinción por lo que se suelen realizar contrastes con sustancias o metales pesados con distinta afinidad por los componentes celulares; ejemplos de esto son: el ácido fosfotunstico que permanece en los componentes lipídicos (acúmulos de grasa, membranas plasmaticas...), acetato de uranilo (con metal pesado uranio (U²³⁸) y afín por la cromatina, sobre la cual se deposita) que emplearemos en la practica de hoy.

Para que el EPO se embeba bien en la muestra realizamos varias mezclas.  Hígado y cerebro se cortan con criostato.

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Practica III.

Realización de los bloques de parafina, tinción con H-E (hematoxilina-eosina) y técnica de violeta de cresilo.
 

  Bloques de parafina (M.O.) y de resina epoxi (M.E.):

Los bloques de parafina se hacen sobre moldes con poco de parafina líquida que rápidamente endurece a temperatura ambiente. Durante el proceso de inclusión deberemos de colocar el tejido adecuadamente para obtener las secciones deseadas. Es el momento en que elegimos como vamos a ver la preparación. Después de colocarlo se cubre hasta el final con parafina. Después debemos de tener cuidado de no mover el casete.
En microscopía electrónica tenemos epoxi + muestra sin endurecedor; se rellena con EPON (ver guión de la clase practica).
Una vez tenemos el tejido en parafina podemos ya realizar los cortes suficientemente finos para observar en detalle las estructuras tisulares y celulares. Para esto es necesario llevar a cabo varias técnicas de tinción que realcen dichas estructuras y como los reactivos a emplear suelen estar en soluciones acuosas deberemos: desparafinar, hidratar y aplicar finalmente los colorantes.

Desparafinar: necesitamos una sustancia afín a nuestro medio de inclusión, un liquido desparafinador: el xilol. Por lo tanto deberemos añadir este al principio de nuestra serie de compuestos de hidratación.

Hidratación: no es mas que volver a introducir el agua en las estructuras celulares. Se lleva a cabo mediante la aplicación de líquidos en serie que hidratan la muestra, como alcoholes de mayor a menor graduación y finalmente agua destilada.

Tinción: se vera con mas detalle en los apartados siguientes.
 
 

  TECNICAS DE TINCIÓN.

HEMATOXILINA EOSINA.

Es una técnica muy generalista no valida para detalles concretos que aprovecha las propiedades químicas y afinidades por componentes celulares de los dos reactivos:

• Hematoxilina: reactivo con carácter básico, luego tiene afinidad por los componentes celulares ácidos (aniónicos=carga negativa), tales como el núcleo que se teñirán de color violeta.

• Eosina: colorante de naturaleza ácida, con afinidad por componentes básicos (catiónicos=carga positiva), tales como el citoplasma (principalmente constituido de proteínas), adquiriendo un color rosado.

TECNICAS ESPECIALES: VIOLETA DE CRESILO.

Tienen el fin de buscar componentes determinados dentro de las células. Son varias y más o menos especificas según los componentes que deseemos destacar. En la practica veremos la técnica del violeta de cresilo, colorante básico que tiñe componentes ácidos. Principalmente ribosomas, frecuentes en el nucleolo ("la fábrica de los ribosomas") y en el citoplasma, en especial el de aquellas células con alta biosíntesis proteica, tales como las neuronas (sobre todo motoneuronas). En estas células existen importantes acúmulos de RER (retículo endoplasmático rugoso) con numerosos ribosomas en su superficie. Esta es la sustancia de Nissl de microscopía óptica.

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Practica IV.

Tinción de las muestras.

  Técnicas especiales: Tricrómico de Mallory, PAS.

Son empleadas para la identificación de componentes de la matriz celular y de la colagena, localizada en los tejidos conectivos como el conjuntivo. El tropocolageno constituye el colágeno, y está formado por proteínas lineales: tres a -helices enrolladas por si mismo, dando saltos pequeños que se reflejan en las estrías que aparecen en el microscopio electrónico con una periodicidad espacial de 64 nm.

El colágeno es una proteína con muchas cargas positivas en su estructura (aminoácidos glicina y prolina), lo cual es aprovechado para su tinción. Las técnicas que se utilizan son una impregnación diferencial con competición:  técnicas para colageno, tricrómico de Mallory (se basa en el tamaño de la partícula del colorante y de la textura del tejido).

TRICOMICO DE MALLORY, para la identificación de componentes de la matriz celular.

- Componentes del tricrómico:

Partículas de colorante -  tiñen - de color

Orange G - muy pequeñas - eritrocitos naranja
Fuchsina ácida - medianas - citoplasma y núcleo violeta y rojo
Azul de anilina  - grandes fibras de colágeno azul intenso

La trama de tamaño intermedio es la del citoplasma y el núcleo, se teñirán entonces con la fuchsina ácida de color violeta y rojo respectivamente. La trama de mayor tamaño, correspondiente a las fibras de colágeno con entramado laxo, por donde encajan y se retienen las partículas mayores del colorante azul de anilina se tiñen de color azul.
El tricrómico emplea además un mordiente, el ácido fosfotungstico, una molécula especial que se une muy bien al colágeno, regular al citoplasma y núcleo y mal al eritrocito, dando color negro.

1. En una trama muy grande el colorante difunde, pero los distintos componentes del tricrómico compiten por las cargas positivas, por las cuales tienen afinidad. Estos espacios tan grandes son ocupados por las partículas del azul de anilina, quedando retenidos entre la estructura laxa de las fibras de colágeno del conjuntivo.
2. En una trama mediana, entran el Orange G y la fuchsina, esta última aunque difunde mas lentamente será al final la que quede retenida.
3. En la trama de menor tamaño solo podrán introducirse las partículas más pequeñas del tricrómico, siendo estas las del Orange G que permanecen principalmente en los eritrocitos de los capilares de nuestra sección de muestra.

  IDENTIFICACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO.

Podemos enumerar muchos polisacaridos (almidón, glucógeno, quitina...), mucosustancias neutras, resultado de la combinación de proteínas neutras con polisacaridos (como las producidas por las cels. Caliciformes del intestino), proteoglucanos, de la matriz extracelular en la sustancia amorfa, etc. ... que serán reconocidas por nuestras técnicas de identificación de hidratos de carbono.

PAS (Periodic Acid Schiff)

Técnica de identificación de hidratos de carbono que se basa en la utilización del reactivo de Schiff. Previo al uso de este se emplea ácido periodico que oxida el compuesto transformando un grupo hidroxi (-OH) en ceto (=O) por el cual tiene afinidad el reactivo. El colorante tiñe entonces al hidrato de carbono de color fucsia.

Precauciones muy importantes son: tener en oscuridad el reactivo de Schiff y evitar contaminar este, provocando entonces una reacción que lo inutilizaría. El colorante además solo podrá emplearse en pocas sesiones de tinción.

Como los componentes que se tiñen con PAS (es decir aquellos que son PAS+) están presentes solo en determinadas estructuras (cels. caliciformes), necesitaremos realizar un contraste de fondo con hematoxilina para tener una idea general de cómo es nuestro tejido.

METACROMASIA.

Ciertos componentes de las estructuras tisulares o celulares tienen características que hacen que "vire" el color del colorante. A este fenómeno se conoce como metacromasia y se suele dar en moléculas como el ácido urónico: de alto peso molecular, gran número de cargas negativas próximas y múltiples grupos sulfato.

Por ejemplo, el colorante azul de toluidina, que emplearemos en la practica para teñir la matriz cartilaginosa de la traquea, con propiedades metacromáticas, tiene un color ortocromático a -azul, que vira a un b -azul, metacromático próximo al violeta.

El "salto en el color" se produce no solo por las particulares características de ciertos componentes de nuestro tejido, sino también por la naturaleza de nuestro colorante, el azul de toluidina, de estructura bipolar que une gran cantidad de cargas negativas y a su vez se crean enlaces de hidrogeno entre el colorante y el agua, formándose agregados moleculares, dimeros y trimeros del colorante sobre esos componentes celulares o tisulares.

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Practica V.

Técnicas para histología vegetal.
 

  FIJACIÓN Y OBTENCIÓN DE CORTES FINOS

Los tejidos son más resistentes a la hora de obtener secciones finas por lo que estos se realizan directamente a partir de muestras ya fijadas con microtomos de mano.

Los fijadores mas adecuados en los que pueden conservarse las muestras durante periodos de tiempo relativamente largos son los alcoholes, en particular etanol 70º.

  TINCIÓN

Se va a emplear Carmín – Verde Yodo; el carmín va a colorear las células que contienen pared primaria, aquellas como el parenquima o colenquima, de color rojizo violeta.

El verde yodo teñirá principalmente a las células que presentan importante desarrollo pared celular secundaria, sobre todo aquellas que están lignificadas, como las del esclerenquima.

Previo al proceso de tinción deberemos realizar una decoloración con hipoclorito sódico (lejía) para blanquear la estructura vegetal y eliminar los pigmentos endógenos.

  TINCIÓN DE CELULAS VIVAS

Es una alternativa a la fijación de las muestras. Primero es necesario la realización de una tinción vital, consistente en la sumersión de la muestra en Rojo de Metilo – Azul de Metileno, de tal modo que se nos permita diferenciarlas células vivas (vacuola de color rojo) y las muertas (azul), con los colorantes respectivos.

  TINCIÓN DE SEMILLAS OLEAGINOSAS

Son aquellas que presentan un elevado contenido lípidico. Una de estas semillas es el fruto que se conoce como nuez, del árbol Juglans regia. Las células se deben sumergir en Sudan III, mostrándose las grandes vacuolas de grasa de color rojo. Se montan con glicerol, cubriéndose con un porta; por lo que la vida media de la preparación es muy corta.

  OBSERVACIÓN DE PIGMENTOS

Se realiza directamente, sin necesidad de tinción. Solo un montaje rápido como el indicado anteriormente en las semillas oleaginosas. En la practica se va a ver el pigmento carotenoide CAPSANTINA de color rojo presente en los cromoplastos del epicarpo del pimiento (Capsicum annum).

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Practica VI.

Técnicas para microscopía electrónica.

Hasta ahora las muestras destinadas a microscopía electrónica se han conservado en la estufa. Para comenzar debemos sacar las cajas de esta y eliminar las cápsulas de gelatina empleadas, mediante un baño de agua caliente y agitando periódicamente. Se secan bien y las guardamos ordenadamente asegurándonos de no perderlas.
Es muy importante obtener cortes muy finos, obteniéndolos con el ultramicrotomo mediante el empleo de cuchillas de vidrio o de diamante.

Es de destacar el grosor de las muestras que van a ser observadas al microscopio electrónico. Por encima de 500nm la opacidad será absoluta; deberemos obtener por tanto cortes extremadamente finos, siendo adecuados aquellos que rondan los 500 nm, mejor cuanto mas finos.
En cuanto a las cuchillas a emplear resaltar que las de diamante permiten varios usos pero es más económico utilizar cuchillas de vidrio que se preparan a partir de barras que se cortan hasta obtener triángulos en los que un extremo tendrá el filo buscado (para conocer cual es este las barras vienen con dos huecos muy finos dentro que nos servirán de referencia).
A esta cuchilla de vidrio se le colocara una cinta adhesiva brillante bordeando el extremo con el que cortaremos la muestra, de tal modo que se cree una balsa donde caerán los cortes y donde podremos diferenciarlos según su grosor, aprovechando el color que reflejan.

El ultramicrotomo posee unos binoculares que nos permitirán ver donde hay muestra, retirando en una primera fase el excedente de resina epoxi alrededor de la muestra.
Seguidamente se obtendrán cortes semifinos, con un grosor aproximado de 1-1,5 m m, que se teñirán con azul de toluidina y se observaran al microscopio óptico. Tendremos así una idea del tejido y de la posición de las estructuras que queremos ver al microscopio electrónico, procediendo a continuación a eliminar tejido endurecido con epoxi, obteniendo cortes menos grandes que cabrán en la rejilla de cobre.

Una vez tenemos varios cortes sobre la balsa de la cuchilla, y aprovechado la luz que reflejan, se continua "pescando" la muestra directamente con la rejilla de cobre (de cerca de 4 mm de diámetro) y mediante el uso de pinzas para microscopía electrónica.
Las secciones ultrafinas de 600-500 nm tienen un color dorado, siendo plateado cuando está próximo a los 500 nm. Los cortes mas adecuados son estos últimos, de aproximadamente 500 nm (=0.5 m m).
Después de tener los cortes sobre las rejillas debemos insistir con el contraste de la muestra para realzar estructuras, utilizando acetato de uranilo y citrato de plomo.
 
 

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Anexos.

No se incluyen con este cuaderno de prácticas:

• BORRADORES DE PRACTICAS DE FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA CELULAR
• GUIONES DE CLASES PRACTICAS DE FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA CELULAR
• ESQUEMAS ROTULADOS DE ALGUNAS DE LAS PREPARACIONES OBTENIDA

Los protocolos vienen en los GUIONES DE CLASES PRACTICAS DE FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA CELULAR y los esquemas rotulados se realizaron en estos junto a sus descripciones respectivas.

Algunos detalles que no aparecen en este cuaderno de practicas son resultado de la omisión de estos, que se encuentran más que explicados en los GUIONES DE CLASES PRACTICAS DE FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA CELULAR (no se pretendía realizar otro guión, sino trasladar las anotaciones realizadas en practicas).
 
 
 
 
 
 

Anexos II

Otras notas. Se indica práctica.
 

Criostato (Práctica II). Si se desean estudiar ciertas estructuras que podrían perderse con los disolventes empleados, como es el caso de los lípidos, se pueden utilizar otros métodos para obtener secciones finas para microscopía óptica (de 1-2 m m).
El microtomo de congelación es un tipo sofisticado de microtomo que evita pasar por todas las etapas necesarias para endurecer la muestra, haciendo esto por congelación y obteniendo los cortes finos que buscamos.
Otro tipo mas preciso es el criostato, empleado en la práctica. Tiene varias ventajas: es mas rápido para el estudio histológico, pudiéndose obtener muestras durante una operación y esperar hasta obtener resultados.
Además en la congelación no se inactivan enzimas y se dificulta la difusión de moléculas pequeñas.

Nota sobre la tinción con Giemsa. El Giemsa es un colorante neutro constituido por dos iones, ambos con cromóforos:

          Eosina: componente ácido (-). Une estructuras de carácter básico dando color rosado.
          Azur B y Azul de Metileno: componentes básicos (+) del Giemsa, color azul.

Al emplear un colorante neutro debemos lavar la muestra repetidas veces, no solo para eliminar el exceso sino para también disociar los iones. En la práctica al realizar esto utilizamos agua del grifo de Murcia, rica en carbonatos y por tanto de carácter básico. Esto ha hecho que se retire prácticamente todo el ion ácido, de carga negativa: la EOSINA, de tal modo que los fondos de las celulas, los citoplasmas, apenas han resultado teñidas.

En la práctica V de histología vegetal los trozos de tejido fijados en alcohol 70º se introducen en huecos de medula de sauco (Sambucus sp.) para que queden bien fijos en el microtomo manual y se puedan cortar.

En microscopía electrónica los cortes precisan tener un grosor entre 0.02 a 0.1 m m (20-100 nm). En el resumen de la práctica VI se indica un grosor mayor (¿?).